大家好，今天给大家推荐的是最近发表在Nat.Commun.上的一篇文章，本文的通讯作者是复旦大学张凡教授。
光成像具有非侵入性、实时、快速反馈和高灵敏度等优点，在活体生物医学成像分析和传感领域发挥着重要作用。在外部光源激发时，复杂生物器官和组织中内源性荧光团产生的自发荧光背景是获得具有高信噪比（SNRs）成像的主要限制之一。生物发光成像和化学发光成像等无需外界光源照射的成像策略引起了研究人员的极大兴趣。目前，生物发光成像已被广泛用于跟踪细胞、肿瘤成像等。然而，常规生物发光成像的可见光波长短（-nm），在体内成像时存在组织穿透不够、灵敏度低等问题。通过生物发光共振能量转移（BRET），生物发光成像的发射波长可扩展到近红外I区（NIR-I，-nm），有助于肿瘤和淋巴结成像以及酶活性分子成像，但其生物组织的散射效应依然影响成像的信噪比和分辨率。近红外二区（NIR-II，-1nm）光学成像可以在深部组织（1cm以上）中实现更高的空间分辨率。但是，活体内NIR-II荧光成像由于需要外部光照，不可避免地会出现自发荧光背景、并且会产生光致过热效应、照明不均匀等不良现象。
本文报道了基于特殊设计的花菁染料FD-的NIR-II生物发光探针（NIR-II-BPs）的开发，FD-进行生物发光共振能量转移（BRET）和两步荧光共振能量转移（FRET）后，即可在NIR-II成像（图1）。与在血管和淋巴系统上进行的NIR-II荧光成像相比，使用NIR-II生物发光成像可显着提高SNR，并提高空间分辨率。能量转移策略的灵活性还可以调节生物发光探针的发射波长，从而可以在活体小鼠中同时对浅表血管和肿瘤组织进行高性能的多色成像。此外，由于NIR-II-BPs依赖于三磷酸腺苷（ATP），在实体瘤和转移性肿瘤中进行细胞内ATP介导的成像时，肿瘤与正常组织（T/N）的比率较高，这表明NIR-II-BPs在转移灶追踪中可能具有很大的前景。
图1：合成NIR-II-BPs的示意图和NIR-II生物发光的机理
FD-的最大吸收和发射分别在和nm（图2b、2c）。为了消除萤光素酶和FD-之间的能量传递间隙，因此引入了两种商用有机染料（Cy5和Cy7.5）（图2d）。通过两亲性聚合物DSPE-PEG-COOH的自组装，生成了负载有Cy5，Cy7.5和FD-的单分散胶束，具有改善的生物相容性和水溶性。之后，将荧光素酶缀合至胶束，以产生最终的NIR-II-BPs，在PBS缓冲液中的TEM图和的粒径分布其直径为25.0±6.3nm（图2e）。在准备好的NIR-II-BPs中，观察到宽的UV/VIS/NIR吸收，最大吸收波长为nm。加入D-荧光素后，可以清楚地识别出、、nm处的三个弱发射以及nm处的一个强NIR-II峰（图2f）。由于NIR-II-BPs也适用于NIR-II荧光，因此还在连续照射nm光的情况下，在此模式下测试了光稳定性，以进行比较，在这种情况下，观察到头90分钟急剧下降至19.4％，并且分钟后仅剩下初始NIR-II荧光强度的8.8％（图2g）。紧接着研究了三个检测窗口（-、-和nm，由不同的滤光片隔开）中生物发光的穿透深度和空间分辨率。如图2h所示，对于所有三个检测窗口，随着组织深度从0毫米增加到10毫米，毛细血管的可见性下降。在两个短波长窗口中观察到较浅的穿透深度（5mm）以及严重的光子散射（图2i）。相比之下，超过nm的NIR-II生物发光成像显示毛细管的锐利边缘具有较大的穿透深度（10mm）（图2h）。
图2：NIR-II-BPs的合成与表征
在常规的荧光成像过程中，需要外部激发光（从紫外线到近红外光），并且不可避免地会引起器官和组织的自发荧光背景。我们首先通过NIR-II生物发光成像和NIR-II荧光成像（图3a）评估了填充有NIR-II-BPs溶液的毛细管的SNRs，该溶液覆盖有不同厚度的鸡胸组织。尽管在NIR-II荧光成像中可以清晰地检测到组织自体荧光信号（图3b，顶部），但是在没有外部光的情况下，使用NIR-II生物发光成像可以基本消除这种背景噪声（图3b，底部）。与NIR-II荧光成像相比，NIRII生物发光成像期间，所有不同厚度的组织（最大10mm）的信噪比均提高了（1.5-3倍）（图3c），表明成像清晰度得到了改善。另外，来自激发光的过热效应也可能是体内成像的潜在不利因素。本文选择了三种能够激发NIR-II-BP的光源（nm，nm和nm）来研究在最大允许暴露极限下对鸡胸组织的光热效应（图3d）。由于在nm处有很强的吸水峰，因此组织的温度在5分钟内从22.5°C迅速升高到42.5°C，并且如果施加nm的光，则随着时间的推移持续升高（图3e，f）。相比之下，由于组织对光的吸收系数降低，当分别暴露于nm和nm激光下时，组织温度分别升高约3°C和约7°C（图3e，f）。在体内光热研究中（图3g，h），裸鼠的皮肤温度在nm激光的照射下在30分钟内升高到48°C，这可能对生物体造成破坏性和致命性。同样，在同一时间段内，nm和nm的激光照射也会对生物体产生光热效应，从而使小鼠皮肤的最高温度升高约5°C（图3g，h）。
图3：NIR-II生物发光和荧光成像之间信噪比和光热效应的差异
将NIR-II-BPs应用于体内NIR-II生物发光成像。首先，在人卵巢癌细胞系CaOV-3中评估了NIR-II-BP的细胞*性研究（SI）。当与浓度为μgmL-1的NIR-II-BPs孵育24小时时，仍有90％以上的细胞存活，这表明NIR-II-BPs具有良好的生物相容性。接下来，作者通过尾静脉注射立即应用NIR-II-BPs，ATP和D-荧光素的混合物，对小鼠腹部血管和淋巴管进行了实时NIR-II生物发光成像。注射后约5分钟，在NIR-II荧光成像中清楚地检测到来自腹腔血管和肝脏的强烈荧光信号以及组织自身荧光背景（图4a，右）。但是，在NIR-II生物发光成像中，这些自体荧光背景噪声被大大降低（图4a，左），从而导致腹部血管更清晰，半峰全宽（FWHM）小于其最大宽度的1.3倍（成像深度大约1mm）。NIR-II荧光成像（图4d）。同时，通过NIR-II生物发光成像对血管的SNR也比NIR-II荧光成像提高了近5倍。在更清晰的淋巴管成像（FWHM降低了1.5倍）和高SNR（提高了5倍）（图4b，e）和脑血管成像（FWHM降低了33％，SNR升高了3.5倍）中也获得了类似的结果。（图4c，f）。
图4：比较NIR-II生物发光和荧光信号在血管和淋巴管上成像
作者对NIR-II-BPs进行了原位ATP介导的肿瘤示踪。携带异种移植人卵巢腺癌肿瘤的裸鼠被用作模型。首先将NIR-II-BPs通过尾静脉静脉注射入裸鼠。为了在肿瘤部位充分积累NIR-II-BPs，在24小时后进行第二次D-荧光素注射。荧光素D注射后10分钟后，立即进行NIR-II生物发光成像，并在肿瘤部位观察到强NIR-II生物发光信号（图5a），NIR-II生物发光成像T/N比较高（图5b）。接着作者做了NIR-II-BPs在转移性肿瘤追踪中的潜在应用。在淋巴结转移模型中（图5c），作者同时实施了NIR-II荧光成像和NIRII生物发光成像。在荧光成像过程中，观察到pop淋巴结转移（POM）和整个淋巴管（图5d）。然而，由于强烈的组织自发荧光，骨淋巴结转移（SCM）（SI）很难被发现（图5e）。相比之下，通过NIR-II生物发光成像可以清楚地显示POM和SCM（图5d，e）。利用敏感的ATP介导的特性，T/N比（83.4）比NIR-II荧光成像（2.5）提高了33倍，在淋巴结转移的追踪中也显示了更高的准确性。为了验证NIR-II-BPs在更复杂的生理环境中的肿瘤追踪能力，我们进一步在携带人卵巢腺癌腹膜转移瘤的小鼠中对其进行了测试。在给予NIR-II-BPs可使转移瘤中最高的NIR-II-BPs富集后8小时后，将D-荧光素通过尾静脉注射到小鼠体内（SI）。通过NIR-II荧光成像，以低T/N比几乎无法区分出四个肿瘤。此外，肿瘤与正常组织之间的边界太模糊而无法区分（图5f）。相反，在NIR-II生物发光成像中，以25以上的高T/N比可以清楚地看到这些转移（图5g）。此外，还以高精度（T/N17.3）进一步鉴定出另外三个微小转移灶（1-2mm）（图5f，g）。在NIR-II生物发光成像的指导下切除所有肿瘤（SI）后，进行H＆E染色，并通过锋利的切割边缘（图5h）确认了肿瘤边缘的精确描绘。
图5：ATP介导的NIR-II-BPs用于肿瘤和转移瘤的成像。
本文作者：CSS
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